登革热诊断标准及处理原则附录A：登革热血清学检测方法

A1 应用IgM捕捉ELISA法检测DFIgM抗体

AI.1原理

根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗人谬链单克隆抗体捕获待检测血清中的IgM，再加入特异性抗原和相应酶标单克隆抗体，加底物显色。显色程度与特异性IgM抗体含量呈正相关，以待检血清与特异性抗原和阴性血清（对照）与抗原反应光密度（0D）值的比值，作为判定IgM抗体反应的标准。

A1.2材料

A1.2.1 96孔聚苯乙烯U型塑料板、酶标仪。

A1.2.2 10～100μL可调加样器1支、10 mL吸管若干。

A1.2.3抗人IgM（μ链）单克隆抗体。

A1.2.4抗原

a） Cs/36细胞培养的各型DV为阳性抗原。

b）未接种病毒的正常CJ36细胞为阴性抗原对照。

（抗原制备：病毒接种CJ36细胞，病变达“+++”，冻融3次，用波长14～22 kHz超声波粉碎3次，每次30 s.3 000 r/min离心15 min，上清即为抗原。

A1.2.5抗IgM阴性或阳性对照血清

A1.2.6辣根过氧化物酶标化DVI～4型单克隆抗体。

A1.2.7缓冲液

a.洗液：O.05%吐温-20 pH7.4PBS

b.稀释液：10%牛血清 pH7.4PBS

c.封闭液：1%牛血清白蛋白 pH9.6碳酸缓冲液

A1.2.8底物：邻苯二胺溶液（pH5.O磷酸盐柠檬酸盐缓冲液100mL，邻苯二胺40 mg，30%过氧化氢溶液0.15 mL，临用前按需配制，立即使用）。

A1.2.9终止液：1 mol/L硫酸。

A1.3检测方法

A1.3.1用稀释液按效价稀释抗人μ链，每孔加0.1 mL，加盖，4℃过夜。

A1.3.2弃去抗人μ链。用洗涤液重复洗3次，甩干，加封闭液，每孔0.1mL，37℃水浴2h.

A1.3.3弃封闭液。用洗涤液重复洗涤3次，甩干，加1：10待检血清，每标本加10孔，每孔0.1 mL，37℃水浴2h.

A1.3.4弃血清，用洗涤液重复洗涤3次，甩干，分别加4个型DV抗原及阴性抗原对照，按顺序各加2孔至每份待检血清的10个孔中，每孔0.1mL，4℃过夜。

A1.3.5弃抗原，用洗涤液重复洗涤3次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度的相应的DF酶标单克隆抗体，正常抗原加四个型混合的酶标单克隆抗体，每孔0.1mL，37℃水浴2h.

A1.3.6去标记物，用洗涤液重复洗涤3次，甩干，每孔加入新鲜配制的底物液0.1mL，37℃水浴30 min，显色。

A1.3.7每孔加1 mol/L硫酸溶液0.05mL，终止反应。

A1.4结果判断

A1.4.1 酶标检测仪测定OD值（空向对照调零），见式（A1）。

k=（OD1-OD0）/（OD2-OD0）……………………………………（A1）

式中：OD1——血清与病毒抗原反应的OD值；

OD0——空白孔的OD值；

OD2——血清与正常抗原反应的OD值。

K≥2.1判为阳性。

A1.4.2目测法。阳性抗原孔呈淡黄色，桔黄色或浅棕黄色，阴性抗原基本无色。

A1.5意义

IgM抗体阳性，表示患者新近感染DV，适用于DF早期诊断。

A2血凝抑制（HI）试验检测DF血凝抑制抗体

A2.1原理

DV有血凝索抗原，在适宜的pH条件下能凝集鹅、鸡及绵羊红细胞，引起红细胞凝集现象。这种现象能被加入的特异抗体所抑制，称之为血凝抑制试验（HI）。可用于血凝抑制抗体的测定。

A2.2材料

A2.2.1 U型塑料板（96孔）。

A2.2.2 10～100 μL、100～1 000 μL可调加样器、10 mL吸管。

A2.2.3 1～4型DV鼠脑蔗糖丙酮抗原或DV C6/36细胞抗原，抗原与同型抗体滴度应大于与异型抗体交叉反应2个滴度以上。

A2.2.4稀释液，pH6.4磷酸缓冲液，用于稀释鹅血球。

pH9.O硼酸缓冲盐水，用于稀释血凝素和血清。

A2.2.5鹅血球：于鹅翅下静脉抽血，置于血球保存液混匀，用生理盐水洗3次，最后以2 000 r/min离心15 min医|学教，弃去上清，用pH6.4PBS稀释至0.5%鹅血球悬液，4℃保存备用。

A2.2.6待检血清处理：用生理盐水把血清稀释成1： 10，置56℃水浴灭活30 min.用10倍蚤4℃丙酮处理2次，离心去上清，沉淀物真空干燥，加入pH9.O硼酸缓冲盐水恢复到l：10浓度。4℃过夜。然后每管加入50%鹅血球0. 05 mL，37℃水浴30 min.离心沉淀取上清，即为1： 10处理血清。阴、阳性对照血清同方法处理。

A2.3检测步骤

A2.3.1血凝素滴定

在塑料板上，每孔加pH9.0硼酸缓冲盐水25 μL.各取1～4型DV抗原25 μL各置于第1孔，作倍比稀释，最后一孔混匀后弃25 μL.然后于每孔补加pH9.O稀释液25 μL，各加0.5%鹅血球50 μL混匀，置于37℃水浴作用2h，结果以最高稀释度出现“++”为1个血凝单位，正式试验用4个单位。

A2.3.2血凝抑制试验

在塑料板中，除第1孔外，于各孔加入pH9.0硼酸缓冲盐水25 μL.第1、2孔和第8孔分别加入25μL巳处理待检血清，从第2孔开始，作倍比稀释，最后一孔不稀释，补加pH9.O硼酸缓冲盐水25 μL.然后按顺序予第1排至第4排各分别加入DV1～4型4个单位的血凝抗原25 μL.最后一孔不加抗原。混匀，放37℃水浴2h，再于每孔加0.5%鹅血球50μL，混匀，37℃水浴2h，观察结果。

A2.4结果判断

以完全抑制鹅血球凝集的血清最高稀释度倒数为血凝抑制抗体效价。

A2.5意义

恢复期血清滴度比急性期血清滴度有4倍增高可确诊。

A3补体结合（CF）试验

A3.1原理