含药血清制备方及研究体会

摘要：研究不同给药方式不同采血时间含复方丹参血清对中性粒细胞释放活性氧的影响，探讨含药血清的制备方法。结果发现给药15次后不同采血时间（第15次给药前，给药后0.5h，1h，2h，4h）含复方丹参血清对中性粒细胞释放活性氧具有较高而且相似的抑制作用强度，与给药1次后各采血时间含药血清抑制作用强度有明显差异，提示重复多次给药使血药浓度达到稳态后，在一定时间范围内采血进行血清药理学实验均可获得较高而且相似的药理作用强度。另外含药血清是否需要灭活与实验所选指标及药物本身性质有关。

关键词：@血清药理学/方法；@复方丹参滴丸/药理学中图 血清药理学问世至今已有十余年的历史，在中药及复方的体外药理实验中得到了越来越多的应用。作为一门新兴的实验方法，还存在着诸多问题，建立规范化的方法学是当前含药血清药理学亟待解决的问题之一［1］。本文以含复方丹参血清对中性粒细胞释放活性氧的影响为指标，探讨制备含药血清的方法，旨在为解决上述问题提供一些思路。

1 材料

1.1 实验动物 新西兰家兔（血清供体，制备血清用），雄性，体重2.3～2.6kg；Wistar大鼠（制备中性粒细胞用），雄性，体重350～400g，均由广东省医学实验动物场提供。

1.2 药物 复方丹参滴丸，25mg/粒，天津天使力联合制药有限公司生产，批号：980513. 1.3 主要试剂 刺激剂［2］：酵母100mg悬浮于20mL生理盐水中，沸水浴煮30min，离心清洗2次，用生理盐水配制成5g/L，再取等量的大鼠血清（v/v=1/1）置37℃水浴中30min，离心清洗3次，最后用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.8）配制成原浓度，分装，-40℃保存；鲁米诺溶液的配制［3］：将10.62mg鲁米诺（sigma公司）溶解于3mL二甲基亚砜（汕头化学试剂厂）中制成2×10-2mol/L浓度，分装，-40℃避光保存，临用前用PBS（pH7.8）稀释至1×10-3mol/L浓度。

1.4 仪器 DG3030发光光度检测仪，华东电子管厂生产；HZS-H恒温水浴振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司生产。

2 方法

2.1 含药血清制备2.1.1 实验分组 新西兰兔12只随机分为两组，D组灌服复方丹参滴丸0.5g/kg，给药1次；W组灌服复方丹参滴丸0.25g/kg，每日两次，重复给药15次。

2.1.2 制备血清 D组在给药前及给药1次后0.5h，1h，2h，4h清醒状态下颈动脉采血，无菌分离血清；W组在第15次给药前及给药后0.5h，1h，2h，4h颈动脉采血，无菌分离血清。

将D组6只家兔各相同时间点（给药前，0.5h，1h，2h，4h）的含药血清分别混匀，分为两部分（A、B）。A直接于-40℃保存备用；B于56℃，30min灭活后-40℃保存备用。W组血清处理同上。

2.2 大鼠中性粒细胞（PMN）制备［3］ 大鼠腹腔注射高温灭菌液体石蜡18h后断头处死，用pH7.2的Hank's液60mL冲洗腹腔，洗出液经1500r/min离心10min，低渗溶解法破坏少量的红细胞，Hank's液冲洗两次，最后用PBS（pH7.2）调成1×107个细胞/mL的细胞悬液，冰浴保存。涂片以Giemsa染色，分类记数，中性粒细胞大于90%.以台盼蓝排斥法检测，活细胞数大于98%. 2.3 中性粒细胞化学发光测定［4］2.3.1 观察比较给药1次与15次后不同采血时间含复方丹参未灭活血清对中性粒细胞释放活性氧的影响将100μL中性粒细胞悬液用700μLPBS（pH7.4）稀释后与含复方丹参血清50μL在37℃水浴振摇30min，加入鲁米诺50μL，刺激剂100μL，37℃温育20min后立即放入发光光度检测仪，检测5min内发光强度，仪器自动记录峰值，计算抑制率。实验用6只大鼠，每次实验取1只大鼠的中性粒细胞。

2.3.2 观察比较给药15次后不同采血时间含复方丹参未灭活与灭活血清对中性粒细胞释放活性氧的影响测定方法同上，实验用6只大鼠。

2.4 统计学处理 NDST统计软件用多组间方差分析（t，t'值法）。

3 结果

3.1 给药1次与给药15次后含复方丹参未灭活血清对中性粒细胞释放活性氧的影响给药1次后不同采血时间含复方丹参未灭活血清对中性粒细胞释放活性氧抑制作用强度有明显差异，而给药15次后不同采血时间含复方丹参未灭活血清对PMN释放活性氧具有较高且相似的抑制作用强度。结果见附表及附图。

3.2 给药15次后含复方丹参未灭活与灭活血清对中性粒细胞释放活性氧的影响给药15次后不同采血时间含复方丹参未灭活血清对中性粒细胞释放活性氧具有较高而且相似的抑制作用强度，而不同采血时间的灭活血清抑制作用强度有明显差异。