霍乱弧菌的检测方法

霍乱弧菌的检测方法：

1.生化鉴定：

新从病人分离出古典型霍乱弧菌和ELtor弧菌比较典型，为革兰氏阴性菌，菌体弯曲呈弧状或逗点状，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞。经人工培养后，易失去弧形而呈杆状。取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察，可见细菌运动极为活泼，呈流星穿梭运动。营养要求不高，在PH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。因其他细菌在这一PH不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。

霍乱弧菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，靛基质反应阳性，当培养在含硝酸盐及色氨酸的培养基中，产生靛基质与亚硝酸盐，在浓硫酸存在时，生成红色，称为霍乱红反应，但其他非致病性弧菌亦有此反应，故不能凭此鉴定霍乱弧菌。EL Tor型霍乱弧菌与古典型霍乱弧菌生化反应有所不同。前者Vp阳性而后者为阴性。前者能产生强烈的溶血素，溶解羊红细胞，在血平板上生长的菌落周围出现明显的透明溶血环，古典型霍乱弧菌则不溶解羊红细胞。个别EL Tor型霍乱弧菌株亦不溶血。

2.血清凝集法：

根据弧菌O抗原不同，分成Ⅵ个血清群，第Ⅰ群包括霍乱弧菌的两个生物型。第Ⅰ群A、B、C三种抗原成份可将霍乱弧菌分为三个血清型：含AC者为原型（又称稻叶型），含AB者为异型（又称小川型），A、B、C均有者称中间型（彦岛型）。

1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株，它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同，但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集，抗01群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长，因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株，推荐使用天津生物芯片生产的霍乱弧菌诊断血清。

3.聚合酶链反应法：

1）普通聚合酶链反应法。

核酸扩增技术，即聚合酶链式反应，其基本原理是设计、合成两条寡核苷酸，作为引物，对应于待测病原微生物某一段特异性序列的两端，然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增，使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。一般选择霍乱肠毒素基因ctx的保守序列作为靶基因。一些非产毒株（如环境来源的菌株）有可能通过基因水平转移获得毒力基因成为产毒株，若仅检测ctx基因容易造成漏检。因此，霍乱弧菌的其他重要基因，如毒力协同调节菌毛A基因（tcp A）、o抗原基因（rfb）、外膜蛋白基因（omp）以及毒力表达调控基因（toxR）等也被选用为PcR的靶基因，这大大提高了检测的特异度。

2 ）多重PCR法。

与常规PCR相比，多重PCR一次反应可检测多个基因，节省了时间和成本。国内、外许多学者选用霍乱弧菌的毒素基因ctx、tcp与其他基因如ompW、rfb、hly进行组合，作为共同的靶基因，克服了由于毒力基因特异度不够高而造成的假阳性。多重PcR同时可准确区分不同血清型的霍乱弧菌和快速鉴定其是否为产毒株，可谓一举多得，大大提高了检测效率。

3）荧光定量PCR法。

荧光定量PCR自动化程度高、特异性强、无交叉污染，在霍乱弧菌的快速诊断中得到广泛应用。尤其是近年来，随着引物与探针的设计更精确、多通道荧光PCR仪的开发与广泛使用，多重荧光定量PCR技术日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等优点而广泛应用于病毒、细菌、真菌等多种病原体的快速检测，成为应用的热点。

4.基因芯片：

与PCR方法相比，基因芯片技术能同时获得更多病原学、生物学方面的信息，从而更为全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]运用基因芯片技术对多种致病性弧菌的毒力、毒素、耐药基因及潜在的毒力基因进行全面分析，对掌握这些细菌的致病性及进行有效预防、控制等具有重要意义。医学.教但基因芯片成本较高，距离推广应用尚需时间等待